Autoria: PERECIN, F.; YAMAZAKI, W.; FERREIRA, C. R.; MÉO, S. C.; BIASE, F. H.; MERIGHE, G. K. F.; SARAIVA, N. Z.; TETZNER, T. A. D.; MEIRELLES, F. V.; GARCIA, J. M.

Resumo: Os métodos de sincronização da célula doadora de núcleo para uso em clonagem baseiam-se no bloqueio reverslvel do ciclo celular em pontos especlficos. Idealmente, espera-se que esse bloqueio não provoque prejulzo à viabilidade do embrião reconstituldo após a transferência de núcleo. Este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência do processo de clonagem (taxa de eletrofusão, produção de blastocistos e estabelecimento de prenhez) a partir de dois protocolos de sincronização celular: privação de soro fetal bovino (SFB) ou cultivo celular até confluência. Oócitos bovinos foram recuperados por aspiração folicular postmortem e maturados in vitro (MIV) por 18h em TCM-199 suplementado com 10% de SFB, 1 ug/mL FSH, 50ug/ mL hCG, 1 ug/mL estradiol, 0,2mM piruvato de sódio e 83,4~g/mL amicacina em atmosfera úmida de 5% de CO2 em ar a 38,5°C. Oócitos apresentando extrusão do primeiro corpúsculo polar foram selecionados, corados com 10ug/mL de Hoechst 33342 e enucleados em fluido sintético de oviduto (SOF) tamponado com HEPES, suplementado com 10% de SFB e 7,5ug/mL de citocalasina B. A reconstituição oocitâria foi realizada com dois grupos de fibroblastos bovinos: Grupo A - cultivados sob privação de SFB por 3 a 5 dias (Dulbecco's Modified Eagle Medium -DMEM suplementado com 0,5% de SFB); ou Grupo B -cultivados até confluência (DMEM suplementado com 10% de SFB). Conjuntos citoplasto+fibroblasto foram eletrofundidos em solução de manitol 0,28M, com dois pulsos de corrente direta de 2,OKv/cm e duração de 20s cada. A ativação foi realizada por exposição à ionomicina (5 minutos, 5~M) seguida de incubação em SOF suplementado com 20mM cloreto de estrôncio e .\ O~g/mL de citocalasina B por 6 horas. Os provâveis zigotos foram co-cultivados com células da granulosa em SOF suplementado com 2,5% de SFB e 0,5% de BSA em atmosfera úmida de 5% de CO2 em ar a 38,5°C por 7 dias. Alguns blastocistos de cada grupo foram transferidos para fêmeas receptoras previamente sincronizadas. As taxas de eletrofusão e produção de blastocistos dos dois grupos foram submetidas à ANOVA, com nlvel de significância de 5%. Houve diferença signiticativaentre os grupos A e B quanto às taxas de eletrofusão: 3,66o/a:!:137,% (549 fundido sem 1631 reconstituidos) contra 40,07% % 11,95% (696 fundidos em 1737 reconstituidos), respectivamente; e quanto ao desenvolvimento até blastocisto: 20,58% % 13,84% (113 blastocistos em 549) contra 34,77o/a:!:1 0,47% (242 blastocistos em 696), respectivamente. Tais diferenças proporcionaram produção média de 5,65 e 12,74 blastocistos por sessão de micromanipulação nos grupos A e B, respectivamente. No grupo A não foram diagnosticadas prenhezes aos 30 dias em 25 receptoras inovuladas; no grupo B foram diagnosticadas 4 gestações a partir de II inovulações (36,4%). Embora a privação de SFB permita o desenvolvimento a termo de clones bovinos (Campbell et al., Nature, 380:64, 1996), existem relatos de maior fragmentação de DNA após utilização da privação (Gibbons et aI., Biol Reprod, 66:895, 2002). Ainda, as menores taxas de eletrofusão, produção de blastocistos e estabelecimento de prenhez observadas no grupo A em comparação ao B, indicam que o uso de fibrob'astos submetidos à privação de SFB não é justiticâvel para o procedimento de clonagem em bovinos.

Ano de publicação: 2007

Tipo de publicação: Resumo em anais e proceedings

Unidade: Embrapa Pecuária Sudeste

Palavras-chave: Efeito do protocolo, Produção de clones bovinos, Sincronização celular