Author(s): GITAHY, P. de M.; LIMA, G. M. de S.; SIMÕES-ARAÚJO, J. L.; DE SOUZA, M. T.; BALDANI, J. I.

Summary: DNA plasmid. Bacillus thuringiensis e seus plasmídeos. Purificação de DNA plasmidial por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio (CsCl). Estirpes utilizadas neste trabalho. Condições de crescimento e extração de DNA plasmidial. Preparo do DNA plasmidial e ultracentrifugação gradiente de CsCl. Identificação e coleta das bandas de interesse. Análise eletroforética. Bacillus thuringiensis é uma bacteria que sintetiza delta-endotoxinas letais para diferentes grupos de insetos, sendo a maior responsável pelo mercado ,mundial de bioinseticidas. As proteínas tóxicas são codificadas por genes denomonados cry, presentes em plasmídeos conjugativos com mais de 30 Mda, e que geralmente, são difíceis de serem purificados pelos métodos rotineiros de extração e purificação. O objetivo deste trabalho foi ajustar um metodologia para obtenção dos plasmídeos presentes nas estirpes de B. thuringiensis, a partir da técnica de ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio. Neste caso, foram usados como modelo as estirpes HD-1 e S76 da subespécies kurstaki. O método de lise alcalina e purificação em gradiente de cloreto de césio empregado, permitiu a obtenção de grandes quantidades de DNA plasmidial com alto grau de pureza. Foram realizadas adaptações no protocolo original que tornaram o protocolo utilizado para as estirpes HD-1 e S76 uma técnica menos laboriosa e mais rápida. Ainda houve redução significativa na quantidade de brometo de etídeo empregada e na quantidade de resíduos químicos sólidos contaminados com essa substância, extremamente tóxica, que foram usados no processo. O procedimento de purificação descrito fio um método adaptado para purificação dos pequenos e grandes plasmídeos de B. thuringiensis e foi usado com sucesso para as estirpes HD-2 e S76. Bacillus thuringiensis is a Gram positive bacterium that synthesizes delta-endotoxinas lethal to different groups of insects therefore has been the largest responsible for the worlf market of bioinseticidas. The toxic proteins are coded by genes denominated cry, persents in conjugatives plasmids with more than 30 Mda and that generally are difficult to be purified by the routine methods of extraction and purification. The objective of this work was to adjust the ultracentrifugation methodology in gradient of cesium chloride to obtain purified plasmids in HD-1 and S76 strains of B. thuringiensis subsp. Kurstaki. The procedure allwed to obtain great amounts of plasmids DNA from HD-1 and S76 strains with high degree of purity. In addition, it was less laborious and much faster. Besides, there was significant reduction in the amounts of ethidium bromide and of solid chemical residues contaminated with the toxic substance. The described protocol is a modification of a purification method for small and big plasmids of B. huringiensis strains and could be applied with sucess for strains the HD-1 and S76.

Publication year: 2005

Types of publication: Booklets

Unit: Embrapa Agrobiology

Keywords: Bactéria, DNA, Ácido Nucléico