A presença de Staphylococcus enterotoxigênicos e suas enterotoxinas em leite e derivados é uma preocupação para a indústria e órgãos governamentais responsáveis pela saúde pública. S. aureus é a espécie mais frequentemente associada a surtos ou casos de intoxicação alimentar estafilocócica. Por ser este microrganismo um importante patógeno de mastite em bovinos, o úbere do animal infectado é uma das principais fontes de contaminação do leite cru. Outras espécies de Staphylococcus também tem sido associadas, mas com frequência muito menor à toxinose estafilocócica de origem alimentar. Neste trabalho objetivou-se avaliar o potencial enterotoxigênico de 300 Staphylococcus spp. isolados da glândula mamária de vacas de rebanhos do estado de Minas Gerais, de leite pasteurizado e queijos Minas frescal comercializados em Juiz de Fora, MG e efetuar a caracterização molecular das estirpes enterotoxigênicas. As estirpes com potencial enterotoxigênico foram identificadas através da técnica de PCR pela amplificação de fragmentos dos genes que codificam as enterotoxinas clássicas SEA-SEE (sea, seb, sec, sed, see) e as novas enterotoxinas SEG-SEL, (seg, seh, sei, sej e sel). Os isolados foram analisados por PCR para o gene femA para identificação dos S. aureus. Para os demais isolados, apenas os confirmados como sendo enterotoxigênicos pela PCR, foram identificados através do sistema API®-STAPH (BioMérieux, Marcy-l`Etoile - França). Os isolados potencialmente enterotoxigênicos tiveram o seu perfil eletroforético determinado por eletroforese em campo pulsátil (PFGE) e fragmentos de genes de enterotoxinas sequenciados. Este estudo contribuiu para melhor conhecimento das espécies de Staphylococcus enterotoxigênicas, os genes de enterotoxinas e os clones que predominam.