A metodologia desenvolvida pela Embrapa associa o congelamento celular ao cultivo de estruturas em tamanho reduzido da planta. Pela primeira vez, a crioterapia é aplicada em plantas de abacaxizeiros. O protocolo obteve a remoção do complexo viral da murcha Pineapple Mealybug Wilt-Associated Virus (PMWaV), produzindo mudas sadias. A murcha pode envolver associações entre três vírus, e é, ainda, transmitida por uma praga. Atinge as variedades de abacaxi mais difundidas em todo o mundo, a Smooth Cayenne e a MD12. No Brasil, onde domina a variedade Pérola, a doença mais importante é a fusariose, causada por fungo. Mas variedades resistentes a essa doença mostram-se suscetíveis à murcha. A nova metodologia apresenta-se como alternativa importante de limpeza clonal de vírus para abacaxizeiros do País e do mundo. A expectativa é que o protocolo seja adotado também em biofábricas.. Um protocolo que se baseia no congelamento de células (crioterapia) foi desenvolvido pela Embrapa pela primeira vez para a cultura do abacaxizeiro visando a remoção do complexo viral da murcha Pineapple Mealybug Wilt-Associated Virus (PMWaV), transmitido pela cochonilha Dysmicoccus brevipes, uma doença que pode impactar muito o cultivo. Esse protocolo se baseou em técnicas de criopreservação dessa fruteira, estabelecidos anteriormente em parceria com o National Center for Genetic Resource and Preservation (NCGRP /Usda), que pertence ao Departamento de Agricultura daquele país. O vírus é a doença mais importante da cultura em todo o mundo, uma vez que as variedades mais difundidas da planta (Smooth Cayenne e MD12) são altamente suscetíveis a ele. Cientistas de diversas instituições de pesquisa dedicam-se a desenvolver cultivares resistentes. No entanto, até o momento não se conhece fonte de resistência a esse vírus. A nova metodologia recorre ao congelamento celular em associação ao cultivo de ápices caulinares (estrutura que possibilita a geração de uma nova planta) em tamanhos bem reduzidos e surge como uma alternativa importante, para a cultura em todo o mundo, de limpeza clonal do vírus da murcha. A expectativa é que o protocolo seja também adotado na rotina de biofábricas, com produção de mudas sadias. No Brasil, onde a variedade preferida pelo consumidor e pelo produtor é a Pérola, a doença mais importante é a fusariose, também conhecida por gomose ou resinose, causada pelo fungo Fusarium guttiforme, que acarreta danos severos aos frutos, inviabilizando a sua comercialização. Mas a murcha tem ganhado importância para a pesquisa no País nos últimos anos. Na busca por variedades resistente à fusariose, o Programa de Melhoramento Genético de Abacaxi gerou três híbridos (BRS Ajubá, BRS Imperial e BRS Vitória) resistentes a essa doença, mas suscetíveis à murcha do abacaxizeiro, provável herança do Smooth Cayenne, um dos parentais usados na hibridação. “Buscar soluções para a murcha também é muito importante”, afirma a pesquisadora da Embrapa Mandioca e Fruticultura(BA) Fernanda Vidigal Duarte Souza. Complexo viral A propagação do abacaxizeiro é vegetativa, o que favorece a disseminação de doenças, incluindo as viroses. O ideal é o plantio de mudas produzidas a partir de matrizes sadias ou de mudas obtidas em biofábricas que utilizem técnicas de micropropagação. Entretanto, o produtor muitas vezes dá preferência a mudas de campo, mais baratas, de acesso mais fácil, mas sem nenhuma garantia de qualidade sanitária. “Mudas sadias são fundamentais para o controle tanto da fusariose quanto da murcha associada à virose”, afirma o também pesquisador da EmbrapaDomingo Haroldo Reinhardt. Segundo o pesquisador Eduardo Chumbinho de Andrade, responsável pelo Laboratório de Virologia da Embrapa Mandioca e Fruticultura, como não existem sintomas visuais no fruto, em geral a doença é pouco percebida pelo produtor: “O que acontece é um desempenho pior da planta. Os frutos, muitas vezes, são menores e têm menor valor de mercado. Ou seja, na classificação do fruto, ele perde por qualidade. A murcha é um problema difícil porque envolve vírus e uma cochonilha, um inseto que, além de transmitir o vírus de uma planta para outra, também é praga. E, mesmo que o produtor consiga controlar a cochonilha, pode ainda não perceber a murcha na área”. No caso da murcha, ocorre um complexo viral, uma vez que existem três tipos de vírus e é possível encontrar na planta o tipo 1, o tipo 2, o tipo 3 ou associações entre eles. “A teoria da cultura de tecidos diz que, ao se introduzir um tecido meristemático in vitro e resgatar aquela planta, consegue-se eliminar o vírus, mas percebemos que, em abacaxi, não funciona exatamente assim. O vírus fica localizado em uma região do tecido meristemático muito próximo às células mais adensadas, então é preciso fazer um trabalho um pouco diferente”, explica Fernanda. Tecidos meristemáticos são de origem embrionária, constituídos por conjuntos de células que têm a capacidade de sucessivas divisões e ocorrem em órgãos de crescimento. BAG de Abacaxi Um resultado importante é que a crioterapia tem sido usada para limpar plantas contaminadas do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Abacaxi. Instalado no campo experimental da Unidade, o BAG é a base para a geração de novas variedades e novos produtos, que vão desde abacaxis ornamentais e fibras vegetais a biomoléculas para a geração de fármacos importantes. “Hoje, quando olho para o canteiro onde mantemos as plantas livres do vírus antes de retorná-las para o BAG em campo, vejo plantas lindas e sadias, diversos acessos com diferentes cores, tamanhos e formatos. Isso é muito gratificante e nos dá ânimo para continuar o trabalho porque, quando a murcha começou a aparecer em plantas do BAG no campo, ficamos todos extremamente preocupados. Temos ali materiais que, se precisarmos voltar para buscar no local de origem, não existem mais por diversos motivos, seja por erosão genética ou por ação do homem, como construções, expansão de áreas agrícolas ou imobiliárias, incêndios etc. Foi por causa do BAG que comecei a fazer esse trabalho que é a remoção do complexo viral por cultivo de ápices caulinares”, recorda Fernanda. A pesquisadora explica que somente introduzir in vitro por gemas axilares, técnica normalmente utilizada em abacaxi, não é eficiente, não limpa o vírus. “Quando indexávamos a planta novamente constatávamos que o vírus continuava lá. O que eu comecei foi introduzir a planta in vitro e depois tirar o ápice caulinar da planta, após aproximadamente 45 a 50 dias de um subcultivo. Esse é um trabalho que podemos dizer que é cirúrgico porque é preciso cortar o ápice meristemático com aproximadamente 0,5 mm, o que demanda o uso de um tipo de lupa ou estereomicroscópio e uma habilidade especial do operador”, acrescenta. O trabalho realizado por Fernanda Duarte Souza, Eduardo Chumbinho de Andrade e o professor Everton Hilo de Souza, além das bolsistas da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia Patrícia Araújo Guerra, Daniela de Andrade Silva Max e Rafaelle Souza de Oliveira, está registrado em artigo publicado na revista internacional In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, em agosto de 2020, e foi considerado um dos destaques das pesquisas desenvolvidas na Embrapa Mandioca e Fruticultura no ano passado. O trabalho foi financiado pela própria Embrapa, pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (Fapesb) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Foto: Fernanda Vidigal Duarte Souza Uso comercial O engenheiro-agrônomo Herminio Souza Rocha, analista do Setor de Gestão de Transferência e Tecnologia da Embrapa Mandioca e Fruticultura, espera que, em breve, a metodologia possa ser incorporada à rotina de biofábricas. “A probabilidade de mais uma tecnologia para a limpeza clonal do vírus da murcha é de extrema importância para a cultura do abacaxizeiro, tanto no Brasil quanto no mundo inteiro. Produzir mudas micropropagadas para fazer um banco de matrizes que pode ser recontaminado com o vírus da murcha ou utilizar material de plantio que não foi indexado ou limpo é um risco muito grande para o processo produtivo”, diz. Segundo Alexandre Drefahl, da Clona-gen Biotecnologia Vegetal, empresa licenciada para produzir e comercializar mudas dos abacaxis BRS Ajubá, BRS Imperial e BRS Vitória, a limpeza viral é bem difícil, exige técnica e bastante critério. “É preciso um protocolo bem ajustado para conseguir recuperar a planta a partir de uma porção de tecido muito pequena”, afirma. A Clona-gen utiliza a termoterapia no processo de produção de mudas – um processo totalmente oposto à crioterapia – em que o material é cultivado numa condição de temperatura alta e bem controlada por 15 dias. Se a crioterapia permitir a obtenção um explante um pouquinho maior ou a redução desse tempo seria muito interessante”, salienta. Explante é um pequeno fragmento de tecido vivo das plantas para ser cultivado em meio artificial. Testes moleculares É no Laboratório de Virologia que são feitos os testes moleculares para confirmar a presença dos três vírus. Também conhecido por indexação, o processo baseia-se na ampliação e detecção do material genético dos vírus dentro da planta, por meio do equipamento PCR em Tempo Real, o mesmo usado para detecção do coronavírus. “Testamos antes que o material seja introduzido in vitro e depois que acontece todo o processo de crioterapia e aclimatação. Ou seja, depois que a planta regenera, testamos de novo para saber se, de fato, o vírus foi eliminado”, destaca Andrade. Como rotina para o Laboratório de Cultura de Tecidos, que abriga as plantas do BAG in vitro (duplicata de segurança do banco que está em campo), depois de confirmado que a planta está limpa, passa-se para uma etapa de multiplicação e dez plantas são inseridas no BAG in vitro e outras são encaminhadas para sua reintrodução no campo. “Tudo o que está no banco in vitro hoje está livre de vírus”, assegura Fernanda. O BAG Abacaxi tem em torno de 750 acessos no campo, sendo que cerca de 40% está mantido também in vitro.