Embrapa e parceiros desenvolveram três metodologias para seleção precoce de clones de mandioca com amido ceroso (waxy). Objetivo é produzir em larga escala no Brasil uma variedade de mandioca com esse tipo especial de amido. O amido waxy reduz a perda de água após o produto pronto, o que agrega qualidade e aumenta a vida de prateleira do alimento congelado. Pesquisa faz parte do programa de melhoramento genético de mandioca da Embrapa. Análises genômicas e foliares mostraram bons resultados na diferenciação dos genes waxy e não waxy e geraram artigos científicos. O Ciat, Colômbia, foi o primeiro responsável pela identificação do gene waxy. Parceria pretende incorporar essa característica a uma variedade nacional. Estudos da Embrapa e parceiros desenvolveram três metodologias de seleção precoce de clones de mandioca com amido ceroso (ou waxy). Esses trabalhos integram o esforço da Empresa em obter uma variedade de mandioca com esse tipo especial de amido que possa ser produzida em larga escala no Brasil. O amido de mandioca é composto basicamente por dois tipos de polissacarídeos: amilose e amilopectina. Normalmente, as variedades comerciais possuem entre 19% e 27% de amilose na composição do amido. O amido waxy apresenta no máximo 5% de amilose, característica de grande interesse principalmente à indústria alimentícia, em função da menor retrogradação do amido (perda de água após o resfriamento do produto pronto). Sendo assim, a mandioca waxy deve trazer benefícios associados à melhor qualidade e tempo de prateleira dos produtos derivados da industrialização de alimentos refrigerados e congelados que possuem o amido waxy em sua composição. Esses trabalhos, publicados recentemente em periódicos internacionais, surgiram da necessidade de acelerar o processo de desenvolvimento de clones waxy do programa de melhoramento genético de mandioca da Embrapa. O objetivo principal é otimizar o processo de seleção dos clones com essa característica de interesse, levando a campo somente os que apresentem o amido waxy. “As metodologias trazem amplas vantagens aos métodos tradicionais de avaliação do amido ceroso em mandioca, que, apesar de precisos, são realizados de forma tardia”, pontua o engenheiro-agrônomo Eder Jorge Oliveira, pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura (BA), autor dos trabalhos junto com uma equipe de estudantes da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), tendo à frente Cátia Dias do Carmo, autora principal dos estudos, que integram sua tese de doutoramento, orientada por Oliveira. Hernán Ceballos, melhorista do Programa de Mandioca do Centro Internacional de Agricultura Tropical (Ciat), na Colômbia, é coautor de dois dos trabalhos. Oliveira enumera os potenciais impactos dessas metodologias: redução da área demandada para o plantio dos clones em pelo menos 75%, possibilidade de realizar cruzamentos já na fase de seedlings (antes das etapas de campo), otimização dos custos do programa de melhoramento genético, garantia de rastreabilidade das futuras cultivares com amido ceroso para fins de proteção dos direitos de propriedade intelectual e, por fim, a otimização do tempo necessário para desenvolvimento de cultivares de mandioca com amido waxy. Carmo avalia os resultados alcançados. “Representam avanços importantes na identificação precoce de genótipos com amido ceroso em mandioca. É gratificante para nós, que trabalhamos com ciências agrárias, ter a oportunidade de desenvolver tecnologias, métodos, com aplicabilidade direta. É uma dupla contribuição: você tem os artigos científicos com o papel de divulgar e contribuir para o conhecimento sobre determinado assunto e métodos com potencial utilização dentro dos programas de melhoramento”, complementa a autora. O problema: teste preciso, mas demorado Convencionalmente, a avaliação do fenótipo waxy é feita no momento da colheita das plantas com uso do teste do iodo nas raízes. Com base nesse teste, é possível separar visualmente pela coloração das raízes se elas são ou não waxy. Embora essa metodologia seja precisa, ela demanda muito tempo, pois o ciclo da cultura é, em média, de um ano. O pesquisador explica que, quando você faz cruzamentos de uma fonte waxy com uma fonte não waxy, todas as sementes derivadas desse cruzamento possuem o fenótipo não waxy. Elas têm o alelo (variação específica do gene que vai determinar como dada característica irá se expressar no indivíduo) do amido ceroso, mas ele não se expressa porque a herança da resistência é homozigótica recessiva. “Com isso, é possível autofecundar ou fazer um novo ciclo de cruzamento entre as plantas F1s para gerar sementes que tenham segregação para o amido ceroso. Essa segunda geração leva a uma segregação esperada de três para um, sendo três partes com fenótipos não waxy, portanto, não desejados, e apenas uma parte, 25%, com fenótipo waxy. Depois dos cruzamentos, ainda é preciso plantar as sementes em casa de vegetação, obter as plantas e fazer o transplantio para o campo para avaliação convencional do fenótipo apenas no fim do ciclo da cultura. Basicamente, avaliamos se são waxy ou não waxy no momento da colheita, quando fazemos o teste do iodo, o que demanda muito tempo”, explica Oliveira. Análises moleculares: alta acurácia na seleção de genótipos Duas das metodologias se baseiam em análises moleculares, com acurácia (precisão) bastante alta. O objetivo do primeiro estudo Mapeamento associativo para amido waxy em mandioca, publicado na revista Euphytica, especializada em melhoramento de plantas, foi avaliar os estudos de associação do genoma para detectar variantes relacionadas ao amido ceroso e identificar genes alternativos ou regiões genômicas responsáveis pela característica. Um total de 351 acessos pertencentes ao Banco Ativo de Germoplasma de Mandioca da Embrapa Mandioca e Fruticultura, juntamente com 31 híbridos de amido ceroso de cruzamentos com a fonte AM206-5 (primeiro genótipo ceroso natural de mandioca descoberto pelo Ciat), foram analisados. O primeiro passo, então, foi desenvolver uma metodologia para localizar o gene. “É uma análise que não necessariamente vai direto ao gene. Ela procura uma localização no cromossomo que pode estar associada ao fenótipo. Dependendo da quantidade de marcadores distribuída ao longo do genoma, é possível detectar, com maior ou menor facilidade, os genes de interesse. Essa é a estratégia. Identificamos uma região no cromossomo 2 que diferencia com muita clareza o waxy do não waxy, e, relativamente próximo a esse loco controlador dessa característica, temos o gene [GBSS1] que condiciona esse fenótipo waxy em outras espécies. Portanto essa versão desse gene também existe na mandioca”, afirma o pesquisador. Oliveira conta que essa metodologia foi precursora do trabalho seguinte, mais refinado de marcação do gene. No segundo estudo, intitulado Identificação e validação de mutações pontuais associadas com o fenótipo waxy em mandioca, publicado na BMC Plant Biology, identificou-se uma série de mutações pontuais que mostram a diferença entre os dois tipos de clones. “Pegamos um grupo de genótipos waxy e não waxy [89 no total], sequenciamos o gene GBSS1 desses clones e alinhamos com sequências de DNA depositadas no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI), base de dados global que reúne dados provenientes da sequenciação de genomas. Descobrimos, assim, regiões que são comuns aos clones waxy e não waxy e, sobretudo, regiões que são diferentes, diversas mutações que mostram diferenças entre clones waxy e não waxy”, descreve o pesquisador. Uma vez feito isso, Oliveira informa que foram desenhados primers (indicadores iniciais), para tentar amplificar essas regiões e checar se havia a possibilidade de separar molecularmente os clones com determinada mutação de outros. Identificou-se, assim, uma mutação específica, e foi desenhada uma série de marcadores para verificar se havia como separar os fenótipos waxy e não waxy. Chegou-se a um tipo de marcador para esse tipo de análise, chamado KASP (Kompetitive Allele Specific PCR). “A estratégia KASP permite muito claramente diferenciar essas duas situações, com uma grande vantagem: além de identificar aqueles 25% de clones que já são waxy, conseguimos selecionar os clones que são heterozigóticos [cujos alelos para determinada característica são diferentes]. Se, porventura, quisermos seguir em frente com algum dos clones heterozigóticos para posterior autofecundação, nós também conseguimos separar esses indivíduos. Isso traz uma grande vantagem metodológica para o programa de melhoramento, ao separar também o que é heterozigótico, ou seja, com pelo menos um alelo waxy, podendo ainda seguir para um segundo ciclo de cruzamento”, afirma. Oliveira ressalta que qualquer programa de melhoramento que use esse marcador vai conseguir com muita acurácia (98%) separar esses tipos de genótipos. E acrescenta que há a perspectiva futura de incluir uma série de outras características hoje já disponíveis para genotipagem nessa plataforma. “Uma espécie de chip para todas as características de forma que, na fase de seedling, consigamos segregar todos aqueles indivíduos que identificamos com maior potencial para se tornar uma variedade.” Análise foliar: menor custo com bons resultados A terceira metodologia, descrita no trabalho Identificação de genótipos de mandioca com amido ceroso utilizando espectroscopia de infravermelho próximo, publicado na Crop Science, já não envolve análise genômica e, sim, análise foliar, por meio da espectroscopia do infravermelho próximo (NIRS) — método que utiliza a interação entre matéria e radiação eletromagnética —, podendo ser realizado logo após a germinação das sementes, ainda em casa de vegetação. Segundo o pesquisador, qualquer composto orgânico que absorve a energia de forma diferencial nessa faixa de NIRS é passível de uso na construção de modelos de classificação do fenótipo. “O amido é constituído basicamente de amilose e amilopectina. No caso do amido comum, você tem uma variação de 19% a 27% de amilose. O restante é amilopectina. No ceroso, você tem praticamente 100% de amilopectina e 0% de amilose. Portanto, há uma diferença muito clara entre o amido produzido pelos clones waxy em comparação com clones não waxy, e essa variação pode ser facilmente captada via NIRS.” Oliveira explica que a síntese do amido acontece nas folhas. Depois é transportado para as raízes. Sendo assim, há como captar essa forma de amido já na folha. As amostras, então, foram padronizadas e usadas para leitura do NIRS. O trabalho consistiu em tentar criar um modelo para classificar se o material é waxy ou não waxy. De acordo com o pesquisador, foram empregados cinco diferentes modelos e escolhidos os dois que apresentaram maior eficiência, com acurácia de classificação acima de 84%. “Isso significa que vou acertar em dizer quais são waxy ou não waxy em 84% das amostras lidas com o NIRS, simplesmente com a análise das folhas, de forma precoce, ainda em casa de vegetação.” A principal vantagem dessa estratégia em relação à análise genômica, segundo Oliveira, é o custo reduzido. Como ele destaca, praticamente é preciso apenas colher a folha, macerar, preparar, fazer as leituras e as predições. Enquanto na análise genômica há um gasto com reagentes, manutenção de equipamentos e custo de serviço, caso o material seja enviado para genotipagem em outra região do País ou mesmo fora. "Apesar de ter menor acurácia do que a análise KASP, a análise de NIR tem essa grande vantagem", pontua. Oportunidades para a mandioca waxy Um avanço importante foi obtido pelo Ciat, que identificou o gene da mandioca responsável pelo amido ceroso. A Embrapa foi a única instituição brasileira que recebeu esse material e agora procura incorporar a produção do amido waxy a uma variedade nacional. As perspectivas de uso do amido waxy de mandioca são promissoras, uma vez que ele tem propriedades diferentes do milho waxy, podendo atingir novos nichos de mercado e permitir a criação de produtos com especificidades únicas. O pesquisador do Ciat Hernán Ceballos conta que há uma conexão interessante entre a mandioca e o milho no que diz respeito à mutação cerosa. Segundo ele, foi no milho que o amido ceroso foi identificado pela primeira vez, na China, mas não foi explorado por décadas após sua descoberta. Durante a Segunda Guerra Mundial, o amido de mandioca da Tailândia não pôde mais ser importado pelos Estados Unidos. Ceballos destaca que as aplicações e usos específicos de cada tipo de amido são tão importantes que cientistas americanos começaram a buscar uma alternativa para substituir o amido de mandioca, que não mais podia ser importado. Descobriu-se, então, que o milho ceroso compartilha muitas das propriedades do amido de mandioca de tipo selvagem nativo. Surge, assim, a indústria do milho ceroso, ainda hoje importante em países onde a mandioca não pode ser cultivada. “Essa história ilustra a importância e o impacto que diferentes tipos de amido têm nas propriedades funcionais e, em última análise, nos usos industriais. Conforme a mutação cerosa foi identificada, características importantes surgiram, e ainda são descobertas, que a tornam muito útil para usos específicos. O amido de mandioca ceroso será particularmente útil para os mercados brasileiros”, complementa Ceballos. Ele menciona ainda a importância da parceria Ciat/Embrapa. “As duas instituições se beneficiaram muito com a troca de germoplasma, experiências e ideias. Sonhamos juntos e trabalhamos muito para tornar esses sonhos realidade. O Brasil é um país-chave na produção de mandioca e líder na mecanização das práticas culturais. O Ciat aprendeu muito com a Embrapa no que diz respeito à mecanização e à produção industrial da fécula de mandioca. Aliás, foi em uma fábrica brasileira de amido de mandioca que, pela primeira vez, surgiu a ideia de buscar a mandioca cerosa”, conta.